نوع مقاله : مقاله‌های پژوهشی

چکیده

مقدمه: روش های زیستی انتقال ژن یا استفاده از ناقل­های ویروسی، کاربرد گسترده ای در اهداف درمانی دارد. استفاده از ناقل های لنتی ویروسی با داشتن مزایایی چون توانایی آلوده­سازی سلول­های تقسیم شونده و غیر تقسیم شونده، توان حمل قطعه ی ژنی بزرگ و بیان پایدار ژن خارجی، ابزاری مناسب برای انتقال ژن در کاربردهای تحقیقاتی و درمانی به شمار می آیند. هدف از این پژوهش تولید یک ناقل لنتی ویروسی بر مبنای HIV-1(Human Immunodeficiency virus) با پوششی از ویروس وزیکولار استوماتیس(vesicular stomatitis virus glycoprotein-G: VSVG) بود. این ناقل می تواند به عنوان وسیله ای برای انتقال ژن به سلول­های تقسیم شونده و غیر تقسیم شونده، در انواع مطالعات تحقیقاتی و درمانی، مورد استفاده قرار بگیرد. مواد وروش ها: روش کلسیم فسفات برای ترنسفکشن همزمان سه پلاسمید شامل پلاسمید بیان کننده ژن خارجی به همراه گزارشگر بیانی(pWPXL-GFP)، پلاسمید بیان کننده پروتئین­های gag و pol(psPAX2) و پلاسمید بیان کننده گلیکوپروتئین پوشش(pMD2.G)، بر روی رده سلولی کلیه جنین انسان، انجام گرفت. تایید ترانسفکشن با استفاده از فلوسیتومتری انجام گرفت و پس از تغلیظ ویروس ها، ترانسداکشن بر رده سلولی هدف انجام شد. یافته ها: نتایج فلوسیتومتری بیان 37/ 51 درصد از ژن گزارشگر پروتئین سبز فلورسانت(Green Fluorescent Protein:GFP) را در سلول­های ترانسفکت شده نشان داد. پس از تغلیظ ویروس و انجام ترانسداکشن؛ دخول پروویروس به ژنوم سلول هدف و بیان طولانی مدت GFP در این سلول­ها با مشاهده به وسیله میکروسکوپ فلورسانت، 15روز پس از ترانسداکشن ارزیابی شد و نتایج مثبت گزارش شد. نتیجه گیری: بیان ژن گزارشگر در سلول ها،پس از ترانسداکشن، صحت ورود ناقل ویروسی را به سلول ها نشان داد و به این ترتیب ناقل تولید شده در این پژوهش علاوه بر کارایی انتقال ژن به دلیل ماهیت لنتی ویروسی آن، توانایی انتقال ژن به سلولهای غیر تقسیم شونده را نیز علاوه بر سلول های تقسیم شونده دارا می­باشدکه موجب کاربرد گستره تر آن، نسبت به سایر ناقل های ویروسی، در مطالعات انتقال ژن میشود. کلید واژه ها: انتقال ژن ، ناقل لنتی ویروسی، ترانسفکشن، کلسیم فسفات ، ترانسداکشن

عنوان مقاله [English]

Construction of lentiviral vector based on HIV-1 virus for gene transfer to dividing and non-dividing cells

چکیده [English]

Introduction: Biological methods or viral vectors are used extensively for gene transfer for therapeutic aims. Lentivial vectors, with advantages such as the capacity of transducing dividing and non-dividing cells, carrying large genetic payloads and stable long-term transgene expression, are considered suitable tools for gene transfer for research and therapeutic purposes. The aim of this study was to produce a lentiviral vector based on HIV-1, with vesicular stomatitis virus glycoprotein-G: VSVG. This vector can be used as a tool for gene transfer to dividing and non-dividing cells for research and therapeutic purposes. Materials and methods: Calcium phosphate method was used for co-transfection of three plasmids pWPXL-GFP (expression vector with reporter gene), psPAX2 consisting of gag, pol gene of HIV-1 virus and pMD2.G (Envelope vector) on HEK293T human embryo cell line. Flow cytometry technique was used for assessment of green fluorescent protein (GFP) expression as a reporter gene. Viruses were concentrated and used for transduction on the target cell line. Results: GFP expression was observed in 51.37% of transfected HEK293T cell line. After concentrating the viruses and transduction, pro-virus penetration into the target cell genome was observed with long-term green positive expression in transduced cells using fluorescent microscopy 15 days after transduction. Conclusion: The ability of constructed viruses to enter host cells was confirmed by GFP expression in these cells. The lentivirus (and therefore the vector) produced in this study proved effective in transducing dividing and non-dividing cells, making it more efficient than other viral vectors in gene transfer investigations.   Key words: Calcium phosphate, Gene transfer, Lentiviral vectors, Transduction, Transfection