مجله دانشکده دندان‌پزشکی اصفهان

بررسی آزمایشگاهی تأثیر آنزیم پروتئاز بر پیشگیری از تشکیل بیوفیلم توسط استرپتوکوکوس موتانس جداسازی شده از پلاک دندان

نوع مقاله : مقاله‌های پژوهشی

چکیده

مقدمه: باکتری‌های رشد یافته در پلاک دندانی مقاومت افزایش یافته‌ای به عوامل ضدمیکروبی پیدا کرده‌اند. این مطالعه با هدف بررسی کاهش بیوفیلم تشکیل شده توسط استرپتوکوکوس موتانس جداسازی شده از پلاک دندانی در اثر آنزیم پروتئاز انجام شد.
مواد و روش‌ها: باکتری استرپتوکوکوس موتانس از پلاک دندانی در محیط Blood agar جداسازی و با آزمون‌های بیوشیمیایی و توالی‌یابی ژن کد‌کننده‌ی S rRNA16 شناسایی گردید. بیوفیلم‌های باکتریایی در چاهک‌های میکروتیترپلیت در محیط Triptic soy broth غنی شده با 1 درصد سوکروز پس از 48 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه‌ی سانتی‌گراد ایجاد شد. سپس حجم معادل 1/12، 2/24 و 4/4 واحد آنزیم پروتئاز در چاهک بر اساس پروتکل شرکت سازنده به طور جداگانه بر روی بیوفیلم‌های تازه تشکیل شده در چاهک‌های مختلف اضافه شد و تأثیر آن‌ها بر ماندگاری بیوفیلم در مدت زمان‌های 60، 90، 120، 150 و 210 دقیقه با روش اسپکتروفتومتری بررسی گردید. تجزیه و تحلیل نتایج با نرم‌افزار SPSS نسخه‌ی 25، بررسی اختلاف میانگین بین گروه‌های مستقل با آزمون Kruskal-Wallis و مقایسه‌ی میانگین‌های جفتی با آزمون Mann-Whitney با سطح معنی‌داری 95 درصد انجام شد.
یافته‌ها: باکتری استرپتوکوکوس موتانس جداسازی شده از پلاک دندانی، دارای 99/8 درصد شباهت با سویه‌ی 0225LPB بود و بیوفیلم آن در غلظت قند 1 درصد چسبندگی متوسط داشت. کاهش درصد بیوفیلم حاصل از استرپتوکوکوس موتانس 0225LPB در هر یک از واحدهای آنزیم دریافتی و در هر یک از بازه‌های زمانی مشاهده شد. بیشترین درصد کاهش بیوفیلم استرپتوکوکس موتانس 0225LPB در 1/12 واحد از آنزیم پروتئاز در مدت زمان 90 دقیقه با 97 درصد کاهش، در میان واحدهای مختلف آنزیم مشاهده شد که درصد کاهش بیوفیلم در این مقدار از آنزیم در مدت زمان 60، 150 و 210 با یکدیگر اختلاف معنی‌داری داشتند (0/0008 = p value).
نتیجه‌گیری: آنزیم پروتئاز قادر به کاهش پلاک دندانی استرپتوکوکوس موتانس 0225LPB بود. بررسی اثر واحدهای مختلف این آنزیم بر پلاک دندانی مخلوط به منظور کنترل پوسیدگی دندان‌های طبیعی و پیشگیری از بیماری‌های پریودنتال ناشی از پلاک دندانی پیشنهاد می‌شود.
کلید واژه‌ها: استرپتوکوکوس موتانس، آنزیم پروتئاز، بیوفیلم، پوسیدگی دندان

عنوان مقاله [English]

The in vitro Survey of the Effect of Protease Enzyme on Reduction of Biofilm Producted by Streptococcus Mutans Isolated from Dental Plaque

چکیده [English]

Introduction: Bacteria growing in dental plaque have increasing resistant to antimicrobial agents. The present study aimed for reduction of biofilm formation by streptococcus mutans isolated from dental plaque by protease enzyme.
Materials and Methods: Streptococcus mutans from dental plaque was isolated in Blood agar medium and then was identified by biochemical tests and sequencing of 16S rRNA coding gene. Bacterial biofilms were formed in wells of microtiter plate in Triptic Soy Broth medium supplemented with 1% sucrose after 48 hrs incubation in 37ºC. Then the volumes equal to 1.12, 2.24 and 4.4 units per well of protease was separately added to recently formed biofilms in different wells based on the manufacturer protocol and effects of them was studied on reduction of biofilms in 60, 90, 120, 150 and 210 minutes by spectrophotometer. Mean differences between independent groups were compared with Kruskal-Wallis test and SPSS25 software statistical tests and paired means were compared with Mann-Whitney test at 95% significance level.
Results: Streptococcus mutans was isolated from dental plaque had 98.90% similarity to LPB0225 strain and had intermediated adherence. Reduction of biofilm percentage by Streptococcus mutans LPB0225 was observed in every of units of enzyme and in every periods of times. The most biofilm percentage reduction by Streptococcus mutans LPB0225 was observed in 1.12 units of enzyme in 90 minutes with 97% reduction. Biofilm percentage reduction in 1.12 units of enzyme in 60, 150 and 210 minutes had significantly differences with each other (p value = 0.0008).
Conclusion: The protease enzyme was able to reduce the dental plaque of Streptococcus mutans LPB0225. The survey on the effect of this enzyme on mixed dental plaques is suggested to control dental caries and plaques created on dentures, and to prevent periodontal diseases caused by dental plaque.
Key words: Streptococcus mutans, Protease enzyme, Biofilm, Dental plaque

1. Forssten SD, Björklund M, Ouwehand AC. Streptococcus mutans, caries and simulation models. Nutrients 2010; 2(3): 290-8.
2. Singh J, Kumar A, Budhiraja S, Hooda A. Ethnomedicine: use in dental caries. Braz J Oral Sci 2007; 6(21): 1308-12.
3. Banas JA. Virulence properties of Streptococcus mutans. Front Biosci 2004; 9(10): 1267-77.
4. Liu Y, Xu Y, Song Q, Wang F, Sun L, Liu L, et al. Anti-biofilm activities from Bergenia crassifolia leaves against Streptococcus mutans. Front Microbiol 2017; 8: 1738.
5. Gugnani N, Pandit IK, Gupta M, Josan R. Caries infiltration of non cavitated white spot lesions: A novel approach for immediate esthetic improvement. Contemp Clin Dent 2012; 3(Suppl 2): S199-S202.
6. Kulshrestha S, Khan S, Hasan S, Khan ME, Misba L, Khan AU. Calcium fluoride nanoparticles induced suppression of Streptococcus mutans biofilm: an in vitro and in vivo approach. Appl Microbiol Biotechnol 2016; 100(4): 1901-14.
7. Peedikayil FC, Remy V, John S, Chandru TP, Sreenivasan P, Bijapur GA. Comparison of antibacterial efficacy of coconut oil and chlorhexidine on Streptococcus mutans: An in vivo study. J Int Soc Prev Community Dent 2016; 6(5): 447-52.
8. Krzyściak W, Jurczak A, Kościelniak D, Bystrowska B, Skalniak A. The virulence of Streptococcus mutans and the ability to form biofilms. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2014; 33(4): 499-515.
9. Tahmourespoor A, Kermanshahi K, Salehi R, Nabinejad A. The in vitro effect of Lactobacillus fermentum on connection of oral streptococcal. Iran J Med Microbiol 2008; 2(1): 45-51. [In Persian].
10. Hu P, Huang P, Chen MW. Curcumin reduces Streptococcus mutans biofilm formation by inhibiting sortaseA activity. Arch Oral Biol 2013; 58(10): 1343-8.
11. Yoo HJ, Jwa SK. Inhibitory effects of β-caryophyllene on Streptococcus mutans biofilm. Arch Oral Biol 2018; 88: 42-6.
12. Kelstrup J, Holm‐Pedersen P, Poulsen S. Reduction of the formation of dental plaque and gingivitis in humans by crude mutanase. Eur J Oral Sci 1978; 86(2): 93-102.
13. Marotta M, Martino A, de Rosa A, Farina E, Cartenı M, de Rosa M. Degradation of dental plaque glucans and prevention of glucan formation using commercial enzymes. Process Biochem 2002; 38(1): 101-8.
14. Ledder RG, Madhwani T, Sreenivasan P, de Vizio W, McBain AJ. An in vitro evaluation of hydrolytic enzymes as dental plaque control agents. J Med Microbiol 2009; 58(4): 482-91.
15. Batra N, Walia M. Production and characterization of alkaline protease from bacteria strains isolated from cotton field. Afr J Microbiol Res 2014; 8(7): 702-9.
16. Jisha VN, Smitha RB, Pradeep S, Sreedevi S, Unni KN, Sajith S, et al. Versatility of microbial proteases. Adv Enzyme Res 2013; 1(3): 39-51.
17. Hosseini F, Shirazi M, Norouzi J. The effects of antimicrobial agents on planktonic and biofilm strains of Streptococcus mutans isolated from dental plague. Ofogh-E-Danesh 2011; 2(52): 5-13. [In Persian].
18. Soltan Dallal M, Dargahi H, Mehrani F, Sharifi Yazdi M, Rahimiforushani A, Miremadi S. The role of Streptococcus mutans in dental caries in two groups of sensitive and resistance children age between 3 to 5 years. Journal of Payavard Salamat 2013; 6(6): 467-77. [In Persian].
19. Rahmandoost S, Amini K. Identification of Streptococcus mutans isolated from dental
plaques based on the presence of gtf B gene. J Isfahan Med Sch 2015; 33(356): 1804-9. [In Persian].
20. Chen YL, Lee CC, Lin YL, Yin KM, Ho CL, Liu T. Obtaining long 16S rDNA sequences using multiple primers and its application on dioxin-containing samples. BMC Bioinformatics 2015; 16(Suppl 18): S13.
21. Shahbazi B, Narenji H. Comparison of four methods of DNA extraction from Gram-negative Gram-positive bacteria. Zanco J Med Sci 2014; 15(45): 9-16. [In Persian].
22. Rahnama E, Naghavi N. Optimization of fermented cow meat quality by lactic acid bacteria in batch fermentation. Journal of Microbial World 2017; 10(3): 263-74. [In Persian].
23. Jebali N, Rabbani Khorasgani M, Kianfar M, Emami H. Evalution of the effects of honey, vinegar and rosewateron adhesion and biofilm formation of Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus. J Isfahan Dent Sch 2016; 12(3): 232-47. [In Persian].
24. Stepanović S, Vuković D, Dakić I, Savić B, Švabić-Vlahović M. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J Microbiol Methods 2000; 40(2): 175-9.
25. Molobela IP, Cloete TE, Beukes M. Protease and amylase enzymes for biofilm removal and degradation of extracellular polymeric substances (EPS) produced by Pseudomonas fluorescens bacteria. Afr J Microbiol Res 2010; 4(14): 1515-24.
26. Festus FI, Pauline DO, Anthony OA. Production characteristics and molecular properties of protease of Pediococcus acidilactici isolated from beef under cold storage. Microbiol Res J Int 2018; 24(4): 1-14.
27. Budtz-jørgensen E, Kelstrup J, Poulsen S. Reduction of formation of denture plaque by a protease (Alcalase®). Acta Odontol Scand 1983; 41(2): 93-8.
28. Hahn Berg I, Kalfas S, Malmsten M, Arnebrant T. Proteolytic degradation of oral biofilms in vitro and in vivo: potential of proteases originating from Euphausia superba for plaque control. Eur J Oral Sci 2001; 109(5): 316-24.
29. Mugita N, Nambu T, Takahashi K, Wang PL, Komasa Y. Proteases, actinidin, papain and trypsin reduce oral biofilm on the tongue in elderly subjects and in vitro. Arch Oral Biol 2017; 82: 233-40.
30. Lequette Y, Boels G, Clarisse M, Faille C. Using enzymes to remove biofilms of bacterial isolates sampled in the food-industry. Biofouling 2010; 26(4): 421-31.
31. Leroy C, Delbarrea C, Ghillebaertb F, Comperec C, Combes D. Effects of commercial
enzymes on the adhesion of a marine biofilm forming bacterium. Biofouling 2008; 24(1): 11-22.
32. Aas JA, Griffen AL, Dardis SR, Lee M, Olsen I, Dewhirst FE, et al. Bacteria of dental caries in primary and permanent teeth in children and young adults. J Clin Microbiol 2008; 46(4): 1407-17.
33. Banerjee UC, Sani RK, Azmi W, Soni R. Thermostable alkaline protease from Bacillus brevis and its characterization as a laundry detergent additive. Process Biochem 1999; 35(1-2): 213-9.
مجله دانشکده دندان‌پزشکی اصفهان
دوره 16، شماره 4 - شماره پیاپی 4
دی 1399
صفحه 437-447